یکی از معروف ترین و البته متداول ترین روش های طیف سنجی، طیف سنجی UV-VIS یا همان طیف سنجی مرئی-فرابنفش است. در این روش، موادی که رنگی باشند و یا توانایی جذب نور فرابنفش را داشته باشند، مورد مطالعه قرار می گیرند.
بنابراین همه کمپلکس های معدنی و بسیاری از ترکیبات آلی را می توان با این روش اندازه گیری کرد. مبنای اندازه گیری در این روش، مقدار نوری است که توسط نمونه جذب شده و خروجی دستگاهی آن به صورت طیفی است که جذب را بر حسب طول موج تابانده شده نشان می دهد. در شکل زیر یک نمونه از این طیف را مشاهده می کنید.
همانطور که مشاهده می کنید، این طیف مربوط به مولکول ایزوپرن بوده که در ناحیه بین 200 تا 340 نانومتر رسم شده و جذب بر حسب طول موج نور تابانده شده را نشان می دهد. یک عبارتی به صورت 
نیز در تصویر وجود دارد که بعدا خیلی با آن کار داریم.
توجه داشته باشید که برای مولکولی مثل ایزوپرن که در ناحیه مرئی جذب ندارد، طیفی هم رسم نمی شود؛ اما این به معنی آن نیست که طیف سنجی در آن ناحیه صورت نمی گیرد. طیف سنجی در تمام ناحیه بین 190 تا 1200 نانومتر انجام می شود اما مشابه با محدوده 280 تا 340 (برای این مولکول) مقدار جذب برابر صفر خواهد بود. بنابراین از آوردن آن صرف نظر می شود.
مبانی نظری طیف سنجی UV-VIS
برای هر چیزی که در فیزیک یا شیمی رخ می دهد، همیشه یک نظریه و کلی تئوری وجود دارد. طیف سنجی UV-VIS نیز از آن مستثنی نبوده و مبانی نظری فراوانی دارد؛ از جمله آن ها می توان به انواع روش های جذب نور توسط مولکول ها، شدت جذبی آن ها در حالت های برانگیخته و پایه و… اشاره کرد.
نور UV-VIS چه تاثیری بر مولکول دارد؟
اگر با نظریه اوربیتال مولکولی (MO theorm) آشنایی داشته باشید، می دانید که در واکنش بین دو اتم، اوربیتال های اتمی اولیه به اوربیتال های مولکولی تبدیل شده و پیوند بین دو اتم اتفاق می افتد. در این صورت دو نوع اوربیتال ایجاد می شود، اوربیتال های پیوندی و اوربیتال های ضد پیوندی.
اوربیتال های پیوندی از برهمکنش سازنده تابع موج و اوربیتال های ضد پیوندی از برهمکنش های مخرب تابع موج ایجاد می شوند. به زبان دیگر، اوربیتال پیوندی، حاصل برهمکنش دو قسمت هم علامت تابع موج و اوربیتال ضد پیوندی، حاصل برهمکنش دو قسمت ناهم علامت از تابع موج های اتم ها یا مولکول های اولیه رخ می دهد. به تصویر زیر توجه کنید:
همانطور که مشاهده می کنید؛ یک تراز انرژی با جفت الکترون در سطح انرژی پایین تر برای حالت پیوند و یک تراز انرژی فاق الکترون در سطح انرژی بالاتر دیده می شود. نور فرابنفش باعث انتقالات الکترونی بین تراز های مختلف، اعم از پیوندی به نا پیوندی و یا ضد پیوندی شده و نور مرئی باعث انتقالات الکترونی بین فلز-فلز یا فلز-لیگاند و … می شود.
در هر حالت، این نور با مکانیسم های مختلف جذب شده و مقدار جذب آن توسط قانون بیر-لامبر قابل اندازه گیری می باشد. آنچه در اینجا برای ما مهم است، تنها یک چیز بوده و آن قانون بیر-لامبر است. این تنها تئوری است که در این نوع طیف سنجی به کار ما می آید؛ بقیه مبانی آن صرفا به درد کار های تئوری خورده و عملا در آزمایشگاه کاربردی ندارند.
اما قانون بیر-لامبر چیست؟ چه کاربردی دارد؟
ما می دانیم که یک ماده مثل همین ایزوپروپن، می تواند نور فرابنفش (یا برای مولکولی رنگی نور مرئی) را جذب کند. بنابراین مقداری از نور دریافتی، توسط مولکول جذب شده و باقی آن عبور کرده و یا پراکنده و یا اصلا بازتاب می شود. روش های طیف سنجی مثل رامان، اساسا بر مبنای سنجش همین نوری که پراکنده می شود ایجاد شده و توسعه یافته اند.
خب پس ما نوری داریم که مقداری از آن توسط نمونه جذب می شود؛ پس می توان با انجام محاسبات دقیق بر روی تابشی که به ماده می دهیم و سپس باقی مانده تابشی که از ماده دریافت می کنیم، نوع ماده و البته مقدار آن ماده را اندازه گیری کنیم.
قانون بیر-لامبر در یک فرمول بسیار ساده به صورت زیر آورده می شود:
در این فرمول، : جذب، : ضریب جذب، : طول سل جذب، : غلظت ماده می باشد. جذب که به صورت یک عدد بدون واحد، بر روی محور عمودی طیف ظاهر می شود و مقدار آن از 0 تا 4 است؛ ضریب جذب یک کمیت منحصر به فرد است که برای هر ماده ای با ماده دیگر فرق دارد (می توانید مقدار آن را برای هر ماده ای از منابع به دست آورید).
طول سل، در حقیقت مقدار مسافتی است که نور، از درون ماده عبور می کند، که این مقدار در سل های UV-VIS دستگاه های اسپکتروسکوپی به صورت استاندارد برابر با 1 سانتی متر در نظر گرفته می شود. و در نهایت غلظت را داریم که به صورت مولار در نظر گرفته می شود.
سل استاندارد برای طیف سنجی UV-VIS
این قانون، صرفا برای جذب های کمتر از 1.2 تا نهایتا 1.5 صادق بوده و برای جذب های بزرگتر انحراف نشان می دهد، به نحوی که دیگ نمی توانید بر مبنای آن، جذب را پیش بینی کنید. پس بهترین کار برای استفاده از دستگاه UV-VIS این است که از محلول های خیلی رقیق استفاده کنید.
اگر محلول غلیظی دارید، آن را به طور مشخص و همیشه رقیق کنید؛ مثلا یک محلول خیلی غلیظ را 100 بار رقیق کنید، به این صورت که 1 میلی لیتر از آن را در بالن ژوژه به حجم 100 برسانید و این کار را تا پایان روند مطالعاتی تان انجام دهید؛ در این صورت، غلظتی که از محاسبه با دستگاه به دست آورده اید را 100 برابر می کنید و غلظت محلول غلیظ اولیه تان به دست می آید.
چگونه از طیف UV-VIS استفاده کنیم؟
همانطور که در بالا اشاره شد، در هر طیف یک عبارتی به نام وجود دارد؛ این عبارت، در واقع طول موجی را نشان می دهد که بیشترین مقدار جذب در آن طول موج اتفاق افتاده است. این طول موج مبنای ما برای انجام تمامی محاسبات می باشد.
ما قانون بیر-لامبر را برای جذبی که در این طول موج اتفاق افتاده به کار می بریم و عملا به جذب در ناحیه های دیگر کاری نداریم(البته فقط برای محاسبه غلظت ماده و الا از شکل طیف نیز می توان برای شناسایی نوع ماده و اطلاعاتی درباره ساختار شیمیایی ماده استفاده کرد).
روند مرحله به مرحله استفاده از روش طیف سنجی UV-VIS چگونه است؟
1_ ابتدا را با یک بار طیف سنجی از ماده به دست آورید و آن را یادداشت کنید؛ از این به بعد، صرفا جذبی که در این طول موج اتفاق می افتد اهمیت دارد.
2_ با استفاده از نمونه های استاندارد (نمونه هایی با غلظت استاندارد) یک نمودار کالیبراسیون رسم کنید. (اگر رسم نمودار کالیبراسیون را بلد نیستید، اینجا کلیک کنید.)
حالا با در اختیار داشتن نمودار کالیبراسیون و می توانید، تغییرات غلظت ماده تان را در نمونه های با غلظت مجهول دنبال کنید. بدیهی است که کاهش جذب در یک نمونه به معنی کاهش غلظت و افزایش جذب به معنی افزایش غلظت نمونه می باشد.
البته مجددا تکرار می کنم که همه این محاسبات بر اساس جذبی است که در دیده می شود.
